产品目录

本制品用于EdU法检测细胞增殖与细胞周期分析，试剂盒中的EdU试剂含有炔烃，而bFluor647染料试剂含有叠氮化合物。点击法的EdU标记增殖快速有效，易于使用。只需少量的叠氮化染料即可非常有效地标记出整合的EdU。标准化的戊二醛固定和去污剂促渗可以使检测试剂进入细胞，而brdu方法则需要DNA变性(如酸变性、热变性或者用DNase消化)去暴露BrdU，从而方便BrdU抗体结合。

EdU成像检测工作流程图

培养细胞

↓

可选：样本处理

↓

EdU孵育细胞

↓

细胞固定与促渗

↓

检测EdU

↓

可选：抗体孵育或其他细胞染色固定

↓

拍照及分析

细胞增殖检测是评估细胞健康程度、遗传毒性及抗肿瘤药物效果的基础实验手段。最精确的检测细胞增殖方法是BrdU法。EdU法检测试剂盒是brdu方法的革命性突破。EdU(5-溴-2-脱氧尿嘧啶)试剂盒是一种嘧啶类似物，可以在DNA合成期整合入DNA双链。EdU法检测是基于“点击”反应，一种由铜催化的叠氮化合物和炔烃的原子共价反应。

组分	100T	500T	1000T	保存条件
组分A：EdU	0.2mL	1mL	2mL	-20℃
组分B：bFluor647-azide	30μL	150μL	3×100μL	-20℃，避光
组分C：10×Click-iT EdU反应缓冲液	1mL	5mL	10mL	2～8℃
组分D：CuSO4	0.5mL	2.5mL	5mL
组分E：Click-iT EdU缓冲液添加物	30mg	150mg	300mg
组分F：Hoechst 33342	25μL	125μL	250μL

针对96孔板培养的细胞，100T可以提供至少100个孔反应的量；500T可以提供500个孔反应的量，1000T是可以提供1000个孔反应的大包装。(不同容器细胞成像的具体用量可参考附表1.EdU培养基及染色反应液的使用量参考)

1. 10mM PBS,pH7.2～7.6
   
2. 中性多聚甲醛固定液(4%多聚甲醛in PBS)
   
3. 促渗试剂(0.5% Triton X-100 in PBS)
   
4. 3% BSA in PBS，pH7.2～7.6
   
5. 去离子水
   
6. 18×18-mm盖玻片

1. EdU标记细胞
   
   1. 以每孔4×10³～1×10⁵细胞接种于96孔板中，进行药物处理或者其他刺激处理。
      
   2. 准备一份2×的EdU工作液(组分A)：以完全培养基稀释10mM的储液至合适的工作浓度。
      
      1. EdU的标记浓度应根据所用的细胞类型做相应的优化选择。预实验中，我们推荐客户以10μM的EdU初始浓度设置一系列的EdU浓度梯度，以确定最佳的合适您的细胞的实验浓度，您也可以参考附表2.常见细胞系EdU孵育时间设定参考以及附表3.细胞实验EdU孵育浓度及时间参考。
   3. 预热2×的EdU工作液，加入等体积的培养基，使浓度变为1×(如：需要得到10μM的终浓度，应以新鲜培养基等体积加入到20μM的EdU工作液中。)
      
      1. EdU孵育细胞的时间可以直接用做测定细胞DNA合成的指标，时间点选择以及孵育时间的长度取决于细胞生长速率。通过短暂的EdU孵育进行的脉冲式标记细胞可以用于研究细胞周期动力学。
2. 细胞固定及促渗
   注意：本参考步骤是针对以4%中性多聚甲醛固定且以0.5% Triton X-100促渗操作样本而优化的操作方法，但本参考所介绍的步骤同样可用于其他类似操作的样本，如以甲醇固定以皂苷固定的样本等等。
   
   1. 孵育完成后，去除培养基加入50μL 4%中性多聚甲醛至各个孔的玻片上，室温孵育15～30分钟后，去除固定液。
      
   2. 以每孔0.1mL 3% BSA in PBS的洗涤液洗涤细胞2次。
      
   3. 去除洗涤液，加入0.1mL 0.5% Triton X-100 in PBS到每个孔中，室温孵育20分钟。
3. EdU检测
   注意：本参考步骤每个孔反应使用100μL的Click-iT反应混合物。用户可以根据自己的样本情况调整等比例减少所用的溶液体积。
   
   1. 准备1×Click-iT EdU反应缓冲液(组分C):转移10×组分C试剂以去离子水稀释10倍即可。
      
   2. 制备一份5×的Click-iT EdU反应添加物储液(组分E)：加0.3mL去离子水至含30mg的E组分试管中，混匀至全部溶解。使用后，剩余储液存放在≤-20℃，可保存一年，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用(注意：不同规格的组分E均按照此比例加去离子水溶解为5×储液备用)。
      
   3. 准备1×Click-iT EdU缓冲液添加物(见表格2)：以去离子水稀释5×储液至1×，溶液应新鲜配制，当天用完。
      
   4. 依据表2准备Click-iT反应混合物。表2要求添加的组分对于反应来说非常重要，否则反应无法有效进行。
      表2.Click-iT反应混合物：
      

      成分	用量(以10个孔的样本数为例)
      1×Click-iT反应缓冲液(组分C)	860μL
      CuSO4 (组分D)	40μL
      bFluor647-azide (组分B)	3μL
      1×反应缓冲液添加物(步骤3.c所准备)	100μL
      总体积	1mL

   5. 去除促渗液，以每孔0.1mL的3%BSA in PBS的洗涤液洗涤2次，去除洗涤液。
      
   6. 加入0.1mL Click-iT反应混合物至每个孔，简短摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖细胞。
      
   7. 室温避光孵育30min。
      
   8. 除去反应混合物，每孔以0.1mL 3%BSA in PBS洗涤2次，去除洗涤液。
      对于核染色，可以进行DNA复染。如其他无特别要求，即可进行拍照分析。
4. DNA复染
   
   1. 以0.1mL PBS洗涤每孔1次，去掉洗涤液。
      
   2. 以PBS稀释Hoechst33342(组分F)储液1∶2000至1×Hoechst33342溶液，终浓度为5μg/mL。
      
   3. 每孔加0.1mL 1×Hoechst33342溶液，室温避光孵育15～30min。除去Hoechst33342溶液。
      
   4. 0.1mL PBS洗涤每孔2次，去除洗涤液。
5. 成像及分析
   表3.荧光发射光谱.
   

   Fluorophore	Excitation (nm)	Emission (nm)
   bFluor647	650	668
   Hoechst 33342,bound to DNA	350	461

附表1．EdU培养基及染色反应液的使用量参考

	96孔板	48孔板	24孔板	12孔板	6孔板	5.5cm小皿
EdU培养基	100μ	150μL	200μL	500μL	1mL	2mL
染色反应液	100μL	150μL	200μL	500μL	1mL	2mL

附表2．常见细胞系EdU孵育时间设定参考

细胞系	人胚胎细胞	酵母细胞	人成纤维细胞 (3T3)	人宫颈癌细胞 (Hela)	人胚肾细胞系 (HEK293)	人神经细胞
细胞周期	~30min	~3h	~18h	~21h	~25h	~5d
孵育时间	5min	20min	2h	2h	2h	1d

附表3．细胞实验EdU孵育浓度及时间参考

细胞系	浓度	时间
NIH3T3,Hela	10 nM～10μM	1 hr
HL-60,A2780,U2OS	1～10μM	30min
Neurospheres	1～20μM	24 hr
Primary fibroblasts	10μM	1,2,4 hr
Chick embryos	10μM～2mM	4 hr
Spleen cells	50μM	24 hr
Human ES cells	10μM	30min
emb-30	1μM	12 hr
VSMC	50μM	2 hr
ESC	50μM	2 hr
fission yeast strains	10μM	3 hr
EJ cells	50μM	4hr
GC cells	50μM	2 hr
U2OS,HT29	30μM	90min
HIT-T15	50μM	4hr
MCF-10A	25μM	2hr
C3H10T1/2	10μM	24hr
EPC	50μM	4hr
SGC7901	25μM	24hr
MSC	50μM	2hr
HCC	50μM	2hr

相关搜索：bFluor647-EdU法细胞增殖检测试剂盒(成像)，EdU法，Click-iT，细胞增值，细胞周期，bFluor647，点击法，bFluor647 Click-iT EdU Imaging Kit